Pathology Techniques - تکنیک های بافت شناسی

آزمایشگاه آسیب شناسی

تکنیک های پاتولوژی ( آسیب شناسی )

دستگاه ها ی مورد نیاز در آزمایشگاه آسیب شناسی

دستگاه تیشو پروسسور Tissue Processor( دستگاه پردازشگر بافت ) 

دستگاه میکروتوم ، دستگاه section Frozen ، دستگاه تیغه تیز کن 

دستگاه  Water bath ، دستگاهParafin bath،دستگاه فور یا

دستگاه اتو، سانتریفوژ، یخچال  و...

ابزار و وسایل کار :

دستکش ، مداد مخصوص ، تخته مخصوص برش ، قیچی ، کارد مخصوص

برش بافت ، تیغه بیستوری همراه با دسته آن ، پنس ، کاست ، کپسول، قالب ،

قلم الماس ، تیغه میکروتوم ، زنبیل رنگ آمیزی ، لام ،لامل ، قلم مو،  ...

مواد مورد نیاز

فرمالین ، الکل متانول ، الکل اتانول ، گزیلول ، اسید استیک ، رنگ هماتوکسیلین ،

 رنگ ائوزین ، پارافین...

خلاصه : آزمایشگاه آسیب شناسی دو بخش دارد بخش تکنیکی که

توسط تکنولوژست آزمایشگاه و بخش تشخیصی که توسط

پاتولوژیست انجام می شود همکاری  درست و منطقی بین این دو بخش

باعث ارائه جواب صحیح به بیماران می شود.

نمونه ارسالی باید  داخل  ظرف مناسب قرار گیرد . به ازای یک حجم بافت باید

ده حجم محلول فیکساتور( فرمالین ) به ظرف اضافه گردیده 

وبعد به آزمایشگاه ارسال شود. 

پذیرش آزمایشگاه

مسئول  پذیرش آزمایشگاه باید از وجود بافت داخل ظرف اطمینان حاصل کند .

مشخصات بیمار: شامل نام ونام خانوادگی بیمار، نام پدر، سن بیمار ،

محل نمونه برداری، تعداد قطعات بافت ، نام جراح ، نام بیمارستان وبخش ،

خلاصه ای از شرح حال بالینی بیمار، تشخیص احتمالی ، تاریخ ورود نمونه

به آزمایشگاه توسط مسئول  پذیرش در دفترآزمایشگاه ثبت می شود .

به علت وجود نام ونام خانوادگی مشابه ثبت نام پدر بیماراز اشتباهات احتمالی

می کاهد.از این به بعد به بیماریک شماره( کد) تعلق می گیرد که در مراحل

 کار در آزمایشگاه این شماره ( کد) معرف بیمار می باشد.

آماده کردن بافت در آزمایشگاه

نمونه های بزرگ توسط شخص پاتولوژیست برش داده می شود.

سپس توسط پاتولوژیست یک قسمت کوچک به ابعاد

(mm 10 mm  x  10mm x 3) از قسمت مشکوک بافت

که آثار پاتولوژیک در آن مشاهده می شود انتخاب می گردد .

 ضخامت بافت انتخابی حدود3mm می باشد.

 زیرا در ضخامت های زیاد بافت خوب فیکس نمی شود . 

 ( کد) بیمار  با مداد گرافیت یا به وسیله مرکب چین روی مقوا نوشته می شود

 تا در مراحل کار محفظ بماند. نمونه همراه با( کد) بیمار داخل کاست قرار داده میشود .

گردش بافت :

از این جا کار با دستگاه اتوماتیک  تیشو پروسسور آغاز می گردد.

دستگاه تیشو پروسسوردر چهار مرحله کار انجام می دهد

      1- مرحله فیکساسیونFixation یا    

2-  مرحله آبگیری یاDehydration

3-    مرحله شفاف کردن  یاClearing  

4-    مرحله آغشتگی  یا Impregnation  

به کوشش : مهدی خواجه – گروه آسیب شناسی دانشگاه علوم پزشکی اصفهان

امانت داری و اخلاق مداری
استفاده از مطالب فقط با ذکر منبع  ونام پدید آورنده " مهدی خواجه "مجاز می باشد.

تثبت یا فیکساسیون یا Fixation:

تعریف : کشتن ناگهانی وهمزمان یاخته های یک بافت به نحوی که حتی الامکان شکل وترکیب یاخته ها نسبت به زمان حیات تغییر نکند را تثبت یا فیکساسیون گویند

آبگیری یا Dehydration

عبارتست ازخارج کردن وگرفتن تمام آب جدا شدنی از بافت بوسیله یک ماده دهیدرانت که در بافت نفوذ کند را آبگیری گویند

شفاف کردن یاClearing

در این مرحله شکاف ها منافذ وچشمه های بافت توسط گزیلل باز می گردد.

گزیلل به عنوان حلال حد واسط بین الکل و پارافین است . زیرا  گزیلل قابلیت مخلوط شدن با الکل و پارافین را داراست. 

آغشتگی یاImpregnation

در این مرحله بتدریج پارافین مذاب به داخل منافذ وچشمه های بافت نفوذ می کند

در نتیجه باعث استحکام وقوام بافت می شود 

مختصری راجع به مراحل کار دستگاه تیشو پروسسور

دستگاه تیشو پروسسور  دو حرکت دارد :

۱-حرکت انتقالی یا حرکت ظرف به ظرف  2 - حرکت نوسانی   

این دستگاه دارای دوازده لیوان مخصوص است .که به ترتیب درلیوان های شماره 1 و 2محلول فرمالین 10% ریخته اند ، لیوان های شماره 3 حاوی الکل 7۰ درجه،شماره 4 الکل ۸۰ درجه ، شماره 5 دارای الکل 9۰ ، شماره 6 و۷ دارای الکل ۹۵ درجه می باشد لیوان شماره ۸ حاوی الکل مطلق است. لیوان های۹ و۱۰ حاوی گزیلول ودر نهایت داخل دو لیوان آخر پارافین وجود دارد. این غلظت ها به تناسب کار ممکن است در آزمایشگاه ها کمی متفاوت باشد

ادامه کار

کاسِت حاوی بافت توسط تکنولوژیست داخل زنبیل مخصوص قرارداده می شود. سپس زنبیل را به حلقه دستگاه تیشو پروسسور می آویزد . به طوریکه زنبیل درلیوان شماره 1 فرود آید.

بعد از گذشت یک ساعت سر(Head) دستگاه به طور اتوماتیک بالا می آید وحدود 30 درجه موافق عقربه ساعت چرخش می کند . به این ترتیب زنبیل در بالای لیوان شماره 2 قرار گرفته سپس سر(Head)  دستگاه به طور اتوماتیک پایین آمده به طوریکه زنبیل در داخل لیوان شماره 2 فرود می آید .

 بعد از گذشت یک ساعت مرحله فیکساسیون یا Fixation با موفقیت به پایان میرسد .

سپس سر(Head)  ) دستگاه به طور اتوماتیک بالا می آید حدود 30 درجه موافق عقربه ساعت چرخش می کند. بدین ترتیب زنبیل حاوی بافت داخل لیوان شماره 3 فرود می آید . این کار مطابق شکل شماتیک ( دستگاه ) ادامه می یابد. تا اینکه مرحله آبگیری یا Dehydration با موفقیت به پایان میرسد .

همانگونه که توجه دارید، در مرحله آبگیری از الکل با درجه صعودی استفاده شده تا آبگیری از بافت به خوبی انجام گیرد .

سوال : چرا جهت آبگیری از الکل بادرجات صعودی استفاده می گردد؟

جواب ها:

۱- هرنوع تغییرات سریع روی بافت موجب تغییر فرم هسته وسیتوپلاسم سلول های بافت می گردد.

2- الکل مطلق (100درجه) موجب انقباض شدید بافت وچروکیدگی وسختی آن می شود . درنتیجه در مراحل کاراز نفوذ مواد به داخل بافت جلوگیری به عمل می آید.

ادامه کار

گردش کار دستگاه تیشو پروسسور به طور اتوماتیک پیش می رود.

مطابق شکل شماتیک ( دستگاه )  تا اینکه در مرحله شفاف کردن یاClearing  چشمه ها ومنافذ بافت توسط گزیلل باز می گردد.

آغشتگی یا Impregnation

در این مرحله بتدریج پارافین مذاب (52 - 56°C ) به داخل منافذ وچشمه های بافت نفوذ می کند در پایان باعث استحکام وقوام بافت  می شود.تمام مراحل فوق توسط دستگاه تیشوپروسسوربه طور اتوماتیک انجام می گیرد

به کوشش : مهدی خواجه – گروه آسیب شناسی دانشگاه علوم پزشکی اصفهان

امانت داری و اخلاق مداری
استفاده از مطالب فقط با ذکر منبع  ونام پدید آورنده " مهدی خواجه "مجاز می باشد.

تا اینجا بافت قوام یافته است . ولی چون شکل هندسی ندارد بازنمی توان آنرا داخل دهانه دستگاه میکروتوم قرار داده واز آن برش های میکرونی تهیه کنیم . لازم است به بافت شکل هندسی بدهیم .

ادامه کار

زنبیل را از داخل ظرف پارافین دستگاه تیشو پروسسور بیرون می آورده. کاست حاوی بافت از داخل  زنبیل خارج کرده آن را به داخل دستگاه اتو 58 درجه انتقال می دهیم .  

قالب گیری Embeding

وسایل مورد نیاز: قالب های آلومینیومی به شکل L ، پارافین ، پنس ، 

دستگاه Parafin bath

روی سطح صاف ( شیشه ای) قالب را با قرار دادن دو قطعه آلومینیوم L شکل در کنار هم ایجاد می کنیم . درب کاست را باز کرده و قطعه بافت را به وسیله پنس بر داشته ودر ته قالب می کاریم . داخل قالب را با پارافین مذاب پر می کنیم . حالا( کد) بیمار را روی سطح پارافین قرار داده با دم  پنس کمی روی آن فشار می دهیم . تا خوب جا گیر شود. قالب را به یخچال انتقال می دهیم . حدود 20 دقیقه بعد پارافین خوب منجمد می شود. وشکل قالب را به خود می گیرد . که به راحتی از قالب آلومینیومی جدا می شود.  بلوک  پارافینه حاوی بافتی آماده گردید.

 برش گیری

تهیه برشهای بسیار نازک 4 تا 7 میکرونی از بلوک پارافینی توسط دستگاه

میکروتوم انجام می شود. تهیه برشهای خوب به تمرین وتجربه زیادی نیاز

دارد .ابتدا بلوک پارافینی را در جایگاه خود روی میکروتوم قرار داده وپیچ

نگهدارنده بلوک را محکم می کنیم . زاویه تیغه میکروتوم را با بلوک را تنظیم

می کنیم . با چرخاندن دسته میکروتوم ابتدا برشهای ضخیم گرفته می شود تا

پارافین روی سطح بلوک برداشته شده و بافت آشکار گردد. سپس درجه میکرون

 دستگاه را روی عدد 5 میکرون تنظیم می کنیم. و با چرخاندن منظم و پی در پی

 دسته میکروتوم برش های نواری  تولید می شود.

به کوشش : مهدی خواجه – گروه آسیب شناسی دانشگاه علوم پزشکی اصفهان

رنگ آمیزی روتین: (هماتوکسیلین  - ائوزین)

طریقه ساخت رنگ هماتوکسیلین:

مواد مورد نیاز:

1) پودر هماتوکسیلین :  gr 5      

2 ) الکل اتیلیک : cc  50 

3) پتاسیم آلوم : gr 100             

4) آب مقطر :  cc 950

5) اکسید مرکوریک :  gr5/2     

6) اسید استیک :  cc4

      رنگ هماتوکسیلین را در ارلن کوچک ریخته و به آن الکل اضافه می کنیم. به کمک حرارت روی بخاری یا داخل بن ماری 56 درجه رنگ را داخل الکل خوب حل می کنیم

پودر پتاسیم آلوم را در یک ارلن مناسب ریخته و به آن آب مقطر اضافه می کنیم. به کمک حرارت و تکان دادن مکرر پودر را داخل آب مقطر حل می کنیم. درحالی که این محلول گرم است. محلول الکلی هماتوکسیلین را به آن اضافه می کنیم. و محتوی ارلن را حرارت داده و مرتب تکان می دهیم. هنگامی که محلول جوش آمد، بی درنگ در کمتر از یک دقیقه ارلن را از حرارت دور کرده و با احتیاط پودر اکسید مرکوریک را اضافه می کنیم ، مجدداً محلول را حرارت می دهیم تا رنگ ارغوانی تیره ظاهر شود. سپس محلول را از حرارت دورکرده و می گذاریم تا سرد شود. اسید استیک اضافه می کنیم. بعد از آن محلول را صاف می کنیم. در این موقع محلول قابل استفاده است ولی بهتر است 2 تا 4 هفته رنگ بماند بعد مورد استفاده قرار گیرد.

2) ساخت رنگ ائوزین:

رنگ ائوزین : gr 1   الکل خالص : cc13

رنگ ائوزین را در الکل حل کرده ، قبل از استفاده به ازای هر cc 100 محلول رنگ 5/0 اسید استیک اضافه گردد. این محلول رنگ استوک ( ذخیره ) است که هنگام استفاده باید به نسبت یک حجم رنگ با دو حجم الکل 80 درجه رقیق گردد.

3) ساخت محلول دیفرانسیاسیون(محلول اسید الکل):

cc  1 اسید کلرئیدریک + cc 100 الکل 70 درجه خوب مخلوط می کنیم.

 روش رنگ آمیزی اسلاید با رنگ H & E  (هماتوکسیلین  - ائوزین)

اسلاید را در زنبیل رنگ آمیزی قرار داده. زنبیل را در داخل دستگاه اتو با دمای 60 درجه قرار می دهیم . حدود 20 تا 30 دقیقه در اتو بماند. با این کار برش ها به سختی روی سطح لام می چسبند حال زنبیل حاوی اسلاید را به ترتیب در محلول های ذیل انتقال می دهیم . رعایت زمان های ذکر شده الزامی است

1) بوکال محتوی گزیلول [5 دقیقه] 2) گزیلول [2 دقیقه] 3) الکل 100 درجه [2 دقیقه]

4) الکل 90 درجه [2 دقیقه]  5) الکل 80 درجه [2 دقیقه]  6) الکل 70 درجه [2 دقیقه]

شستشو در آب جاری با ملایمت [10 دقیقه]  7) ظرف محتوی هماتوکسیلین [10 دقیقه]  شستشو در آب جاری با ملایمت تا آبی شود

8) غوطه ور کردن لامها در ظرف محتوی اسید الکل [دو دفعه]  شستشو در آب جاری [10 دقیقه]  9) قرار دادن در ظرف محتوی رنگ ائوزین [3-5 دقیقه] 10) الکل 70 درجه [2 دقیقه]  11) الکل 80 درجه [2 دقیقه]

12) الکل 90 درجه [2 دقیقه]  13) الکل 100 درجه [2 دقیقه]  14) گزیلول [5-10 دقیقه]  15) گزیلول [5 دقیقه]

تفسیر رنگ آمیزی H & E:

در ظروف شماره 1و 2 پارافین زدایی ، در ظرفهای 3 و 4 و 5 و 6 آب دهی ، در ظرف 8 تمایز، ودر ظرفهای 10 و 11 و 12 و 13 آب گیری و در ظرفهای 14 و 15 شفاف سازی صورت می گیرد.

•         مرحله مونت یا روکش کردن (Cover Slipping):

در این مرحله روی برشهای رنگ آمیزی شده لامل مخصوص می چسبانیم تا برش های روی لام از خراشیدگی و آسیب های دیگر برای سالیان دراز در امان باشند.

•         نتایج رنگ آمیزی H & E:

در رنگ آمیزی H & E  هسته سلول ها آبی می شود. سیتوپلاسم  سلول ها و همچنین مواد کراتینه و الیاف الاستیک و فیبرین برنگ قرمز روشن در می آیند. کلاژن و رتیکولین و رشته های عصبی و آمیلوئید برنگ صورتی در می آیند. گلبول های قرمز رنگ نارنجی می گیرند.